微生物菌種資源的長(zhǎng)期有效保藏是微生物菌種資源有效實(shí)施共享的前提,采用操作性簡(jiǎn)便、保藏周期長(zhǎng)、遺傳變異率低是菌種資源保藏方法的選擇。
液氮罐
1、范圍
本規(guī)程規(guī)定了冷凍干燥和低溫冷凍保藏技術(shù)的定義、原理、技術(shù)要求、方法與步驟。
本規(guī)程適用于普通病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌及擔(dān)子菌等微生物菌種的保藏。
對(duì)于病原微生物及其他需要特殊操作技術(shù)的微生物的參見相應(yīng)的技術(shù)規(guī)程。
2、規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過(guò)本規(guī)范的引用而成為本規(guī)范的條款。凡是注日期的引用文件,其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本規(guī)范,然而,鼓勵(lì)根據(jù)本規(guī)范達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本適用于本規(guī)范。
國(guó)務(wù)院令第 424 號(hào)《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》
GB 19489 實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求
科技部自然科技資源平臺(tái)聯(lián)合管理辦公室文件 自然科技資源共性描述規(guī)范(試行)
3、術(shù)語(yǔ)和定義
下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本規(guī)范。
3.1
冷凍干燥 freeze-drying
將微生物冷凍,在減壓下利用升華作用除去水分,使細(xì)胞的生理活動(dòng)趨于停止,從而長(zhǎng)期維持存活狀態(tài)。
3.2液氮超低溫保藏 preservation in liquid nitrogen
液氮超低溫保藏技術(shù)是將菌種保藏在-196℃的液態(tài)氮,或在-150℃的氮?dú)庵械拈L(zhǎng)期保藏方法,它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。
3.3 -80℃低溫冷凍保藏 preservation in -80℃
將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細(xì)胞的生理活動(dòng)進(jìn)行冷凍的一種保藏方法。
4、內(nèi)容
4.1 微生物菌種的冷凍干燥保藏技術(shù)規(guī)程
4.1.1 好氧菌冷凍干燥管的制備
4.1.1.1 安瓿管準(zhǔn)備
安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時(shí),先用2%鹽酸浸泡過(guò)夜,自來(lái)水沖洗干凈后,用蒸餾水浸泡至pH中性,干燥后、貼上標(biāo)簽,標(biāo)上菌號(hào)及時(shí)間,加入脫脂棉塞后,121℃下高壓滅菌15-20分鐘,備用。
4.1.1.2 保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備
保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí),應(yīng)注意其濃度及pH值,以及滅菌方法。如血清,可用過(guò)濾滅菌;牛奶要先脫脂,用離心方法去除上層油脂,一般在100℃間歇煮沸2-3次,每次10-30分鐘,備用。
4.1.1.3 凍干樣品的準(zhǔn)備
在最適宜的培養(yǎng)條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至靜止期或成熟期,進(jìn)行純度檢查后(參見《微生物菌種純度檢測(cè)技術(shù)規(guī)程》),與保護(hù)劑混合均勻,分裝。微生物培養(yǎng)物濃度以細(xì)胞或孢子不少于108-1010個(gè)/ml為宜(以大腸桿菌為例,為了取得每毫升1010個(gè)活細(xì)胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長(zhǎng)的毛細(xì)滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要濺污上部管壁,每管分裝量約0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,裝量為半個(gè)球部。若是液體培養(yǎng)的微生物,應(yīng)離心去除培養(yǎng)基,然后將培養(yǎng)物與保護(hù)劑混勻,再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時(shí)間盡量要短,最好在1-2小時(shí)內(nèi)分裝完畢并預(yù)凍。分裝時(shí)應(yīng)注意在無(wú)菌條件下操作。
4.1.1.4 預(yù)凍
一般預(yù)凍2小時(shí)以上,溫度達(dá)到-20℃到-35℃左右。
4.1.1.5 冷凍干燥
采用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。
將冷凍后的樣品安瓿管置于冷凍干燥機(jī)的干燥箱內(nèi),開始冷凍干燥,時(shí)間一般為8-20小時(shí)。
終止干燥時(shí)間應(yīng)根據(jù)下列情況判斷:
——安瓿管內(nèi)凍干物呈酥塊狀或松散片狀
——真空度接近空載時(shí)的最高值
——樣品溫度與管外溫度接近
——選用1-2支對(duì)照管,其水份與菌懸液同量,視為干燥完結(jié)
——選用一個(gè)安瓿管,裝1-2%氯化鈷,如變深蘭色,可視為干燥完結(jié)
冷凍干燥完畢后,取出樣品安瓿管置于干燥器內(nèi),備用。
4.1.1.6 真空封口及真空檢驗(yàn)
將安瓿管頸部用強(qiáng)火焰拉細(xì),然后采用真空泵抽真空,在真空條件下將安瓿管頸部加熱熔封。
熔封后的干燥管可采用高頻電火花真空測(cè)定儀測(cè)定真空度。
4.1.1.7 保藏
安瓿管應(yīng)低溫避光保藏。
4.1.1.8 質(zhì)量檢查
冷凍干燥后抽取若干支安瓿管進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢查,如存活率、生產(chǎn)能力、形態(tài)變異、雜菌污染等。
4.1.2 厭氧菌冷凍干燥管的制備
主要程序與需氧菌操作相同
4.1.2.1 安瓿管準(zhǔn)備
參見4.1.1.1
4.1.2.2 保護(hù)劑的選擇和準(zhǔn)備
保護(hù)劑使用前應(yīng)在100℃的沸水中煮沸15分鐘左右,脫氣后放入冷水中急冷,除掉保護(hù)劑中的溶解氧
液氮罐
4.1.2.3 凍干樣品的準(zhǔn)備
參見4.1.1.3
4.1.2.4 預(yù)凍
參見4.1.1.4
4.1.2.5冷凍干燥
參見4.1.1.5
4.1.2.6 真空封口及真空檢驗(yàn)
參見4.1.1.6
4.1.2.7 保藏
參見4.1.1.7
4.1.2.8 質(zhì)量檢查
參見4.1.1.8
4.1.3 冷凍干燥法適用范圍
適用于大多數(shù)細(xì)菌、放線菌、病毒、噬菌體、立克次體、霉菌和酵母等的保藏,但不適于霉菌的菌絲型、菇類、藻類和原蟲等。
4.1.4 保藏周期
不同微生物復(fù)蘇周期不同,一般10年左右。
4.1.5 復(fù)蘇方法
——先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部,
——將安瓿管頂部燒熱,
——用無(wú)菌棉簽沾冷水,在頂部擦一圈,頂部出現(xiàn)裂紋,用挫刀或鑷子頸部輕叩一下,敲下已開裂的安瓿管的頂端,
——用無(wú)菌水或培養(yǎng)液溶解菌塊,使用無(wú)菌吸管移入新鮮培養(yǎng)基上,進(jìn)行適溫培養(yǎng)。
4.2 微生物菌種低溫冷凍保藏技術(shù)
4.2.1 液氮超低溫保藏技術(shù)
4.2.1.1 安瓿管或凍存管的準(zhǔn)備
用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管,或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈, 121℃下高壓滅菌15-20分鐘,備用。
4.2.1.2 保護(hù)劑的準(zhǔn)備
保護(hù)劑種類要根據(jù)微生物類別選擇。配制保護(hù)劑時(shí),應(yīng)注意其濃度,一般采用10-20% 甘油。
4.2.1.3 微生物保藏物的準(zhǔn)備
微生物不同的生理狀態(tài)對(duì)存活率有影響,一般使用靜止期或成熟期培養(yǎng)物。
分裝時(shí)注意應(yīng)在無(wú)菌條件下操作。
菌種的準(zhǔn)備可采用下列幾種方法:
刮取培養(yǎng)物斜面上的孢子或菌體,與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi);
接種液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)后取菌懸液與保護(hù)劑混合分裝于凍存管內(nèi);
將培養(yǎng)物在平皿培養(yǎng),形成菌落后,用無(wú)菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5-10毫米),真菌最好取菌落邊緣的菌塊,與保護(hù)劑混勻后加入凍存管內(nèi);
在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養(yǎng)基,接種菌種,培養(yǎng)2-10天后,加入保護(hù)劑,待保藏。
4.2.1.4 預(yù)凍
預(yù)凍時(shí)一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結(jié)到-35℃。
目前常用的有三種控溫方法:
——程序控溫降溫法,應(yīng)用電子計(jì)算機(jī)程序控制降溫裝置,可以穩(wěn)定連續(xù)降溫,能很好地控制降溫速率。
——分段降溫法:將菌體在不同溫級(jí)的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻,或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫,將安瓿管或塑料小管,先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時(shí),然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。
——對(duì)耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。
4.2.1.5 保藏
將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃,液相中溫度為-196℃。
液氮罐
4.2.1.6保藏周期
一般10年以上。
4.2.1.7 復(fù)蘇方法
從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管,應(yīng)立即放置在38℃-40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇并適當(dāng)搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止,一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管,將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
4.2.1.8 適用范圍
各類微生物。
4.2.1.9 液氮保藏應(yīng)注意事項(xiàng)
——防止凍傷,操作注意安全,帶面罩及皮手套
——塑料凍存管一定要擰緊螺帽
——運(yùn)送液氮時(shí)一定要用專用特制的容器,絕不可用密閉容器存放或運(yùn)輸液氮,切勿使用保溫瓶存放液氮
——注意存放液氮容器的室內(nèi)通風(fēng),防止過(guò)量氮?dú)馐谷酥舷?br />
——防止安瓿管或塑料凍存管破裂爆炸,如液氮滲入管內(nèi),當(dāng)從液氮容器取出時(shí),液態(tài)氮體積膨脹約680倍,爆炸力很大,要特別小心
——注意觀察液氮容器中液氮的殘存量,定期補(bǔ)充液氮。
4.2.2 -80℃低溫冷凍保藏
4.2.2.1 安瓿管或凍存管的準(zhǔn)備
參見4.2.1.1
4.2.2.2 保護(hù)劑的準(zhǔn)備
參見4.2.1.2
4.2.2.3 微生物保藏物的準(zhǔn)備
參見4.2.1.3
4.2.2.4 凍結(jié)保藏
將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。
4.2.2.5 保藏周期
一般1-5年。
4.2.2.6 復(fù)蘇方法
從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管,應(yīng)立即放置38℃-40℃水浴中快速?gòu)?fù)蘇并適當(dāng)快速搖動(dòng)。直到內(nèi)部結(jié)冰全部溶解為止,約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管,將內(nèi)容物移至適宜的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。
4.2.2.7 適用范圍
各類微生物。