目的:尋找一種能最大程度保持液氮貯存人同種主動(dòng)脈瓣活性的復(fù)溫方法。自增壓液氮罐
方法:同種主動(dòng)脈瓣(n=36)隨機(jī)分為6組,Ⅰ組為新鮮同種主動(dòng)脈瓣,Ⅱ~Ⅵ組經(jīng)液氮保存3月后,分別采用①42℃水浴復(fù)溫(Ⅱ組),②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組),③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組),④(10.0±2.0)℃/min(Ⅴ組);⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)。將同種主動(dòng)脈瓣復(fù)溫至4℃,對所有同種主動(dòng)脈瓣進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞計(jì)數(shù)、24小時(shí)葡萄糖代謝率測定,氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入、瓣膜組織培養(yǎng)。
結(jié)果:上述指標(biāo)Ⅰ組顯著優(yōu)于其余各組(P<0.05),Ⅳ組優(yōu)于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P<0.05)。組織培養(yǎng)Ⅰ組細(xì)胞生長優(yōu)于其余各組,且早于各組3~4天。
結(jié)論:不同復(fù)溫方法對同種主動(dòng)脈瓣活性影響不同,以4℃/min勻速復(fù)溫法對同種主動(dòng)脈瓣活性影響最輕。
關(guān)鍵詞:同種 主動(dòng)脈瓣 活性
我們通過本研究觀察不同復(fù)溫方法對同種瓣活性的影響,旨在尋找一種能較好保持同種瓣活性的復(fù)溫方法,為臨床合理應(yīng)用同種瓣提供依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。
材料與方法
1.取材分組 于1995年10月~1996年5月選擇46例健康成人腦死亡者,于死亡30分鐘內(nèi),在無菌條件下取出心臟,隨機(jī)抽取36例(年齡20歲~32歲,平均26歲)分為6組(n=36)。4℃生理鹽水
沖洗、修剪,保留主動(dòng)脈瓣,插入銅-康銅熱電偶測量電極,將同種瓣置入含萬古霉素(50mg/L)、二性霉素(25mg/L)的RPMI1640液,經(jīng)4℃過渡2小時(shí)后移入液氮?dú)庀嘀蟹胖?小時(shí),然后置入液氮中,保存3月后取出,分別以①42℃水浴復(fù)溫(Ⅱ組);②(1.0±0.2)℃/min(Ⅲ組);③(4.0±0.5)℃/min(Ⅳ組);④(10.0±2.0)/min(Ⅴ組);⑤(30.0±4.5)℃/min(Ⅵ組)的速率將同種瓣復(fù)溫至4℃,新鮮未冷凍同種瓣對照(Ⅰ組)。
2.溫度測量控制裝置與方法 根據(jù)升降式降溫儀原理,自制復(fù)溫裝置,如圖1所示。
圖1 升降式溫度測量控制裝置
1 液氮容器 2 銅-康銅熱電偶
3 同種瓣保存袋 4 液氮 5 旋轉(zhuǎn)升降器 6 冰瓶
7 植物油 8 標(biāo)準(zhǔn)探極 9 冰水 10 數(shù)字式萬用電表
3.測量探極置于同種瓣葉內(nèi),標(biāo)準(zhǔn)探極插入冰水瓶,測量兩探極之間電勢差,依公式與攝氏溫度換算。根據(jù)復(fù)溫速度要求,將含有同種瓣材料的托盤,通過細(xì)繩由旋轉(zhuǎn)升降器牽引上升,利用萬用電表顯示電勢差,控制升降速率。換算公式:U=0.0385t+0.00004t2-5.4295×10-8t3,其中U為電勢差值(單位:mV),t為攝氏溫度值(單位:℃)。
4.實(shí)驗(yàn)方法?、倥_(tái)盼藍(lán)染色法:0.25%胰酶消化剪碎的主動(dòng)脈瓣葉,270目纖維濾膜過濾,濾液1200轉(zhuǎn)/分離心15分鐘,棄上清液,按1∶1將5%臺(tái)盼藍(lán)加入細(xì)胞懸液,光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)。②葡萄糖代謝率測定:每10mg瓣膜組織中加入RPMI1640液1ml,在37℃、5%CO2孵箱中孵育24小時(shí)后用自動(dòng)生化分析儀作葡萄糖定量測定。代謝率[mmol/(mg.24h)]其中RPMI1640液原液同條件下葡萄糖定量為11.3mmol/L。③氚化胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR)參入量:瓣葉組織在孵育中加入3H-TdR 2μci,24小時(shí)后取出瓣葉,經(jīng)漂洗后加入2mol/L NaOH,加熱將其溶解,加入閃爍液10ml,用自動(dòng)液閃計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)(CPM)。3H-TdR參入量[CMP/(mg.24h)]=,其中RPMI1640原液本底為27CPM。④組織培養(yǎng):以組織塊貼壁方法在37℃、5%CO2孵箱中RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng),每周換液2次,每次半量,待組織塊周邊有細(xì)胞長出后,拍照。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 臺(tái)盼藍(lán)染色活細(xì)胞百分率行組間χ2檢驗(yàn),葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量以Image12.gif (851 bytes)±s表示,行組間t檢驗(yàn),P<0.05差異有顯著意義。
結(jié) 果
臺(tái)盼藍(lán)拒染細(xì)胞百分率、葡萄糖代謝率及3H-TdR參入量結(jié)果見表1。表1顯示:Ⅱ~Ⅵ組活細(xì)胞百分率(主要為內(nèi)皮細(xì)胞)顯著低于Ⅰ組(P<0.05);而Ⅳ組又顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P<0.05);Ⅰ組葡萄糖代謝率、3H-TdR參入量顯著高于其它各組(P<0.05),Ⅳ組又顯著高于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組(P<0.05)。組織培養(yǎng)Ⅰ組細(xì)胞生長優(yōu)于其余各組,且早3~4天。Ⅱ~Ⅵ組培養(yǎng),Ⅳ組細(xì)胞生長優(yōu)于Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ組。
討 論
同種瓣形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整決定著其耐久性。瓣膜冷凍保存不同于單細(xì)胞,由于細(xì)胞成分多樣,細(xì)胞間質(zhì)存在,在復(fù)溫過程中,使熱量交換不均勻,外周組織內(nèi)冰晶融化可從內(nèi)部吸收熱量,使內(nèi)部組織再結(jié)晶加重,可造成細(xì)胞嚴(yán)重的機(jī)械性損傷。另外,低溫蛋白質(zhì)的變性,脂質(zhì)的丟失,細(xì)胞膜通透性的改變以及細(xì)胞膜上小孔的形成,使水分子易通過細(xì)胞膜,引起細(xì)胞內(nèi)水負(fù)荷加重,超過一定時(shí)間或程度時(shí),細(xì)胞便會(huì)破裂。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同復(fù)溫速率對液氮保存的同種瓣均有損害。臨床上常用的42℃水浴復(fù)溫法,其復(fù)溫速率不均勻,細(xì)胞損害重,活性低,可能與細(xì)胞再結(jié)晶重,高水負(fù)荷狀態(tài)持續(xù)時(shí)間長有關(guān)。30℃/min和10℃/min復(fù)溫,溫差大,細(xì)胞內(nèi)再結(jié)晶重。1℃/min復(fù)溫,雖然再結(jié)晶輕,但細(xì)胞內(nèi)高水負(fù)荷持續(xù)時(shí)間長,細(xì)胞損害亦重。4℃/min復(fù)溫方法較好地保持了細(xì)胞活性,可能與熱交換時(shí)間充裕,再結(jié)晶輕,細(xì)胞內(nèi)高水負(fù)荷狀態(tài)未超臨界值有關(guān)。自增壓液氮罐